Český lékopis 1997

2.2.28   Plynová chromatografie

2001

Plynová chromatografie (GC) je separační metoda založená na rozdílu V distribuci látek mezi dvě nemísitelné fáze: mobilní fází je nosný plyn, pohybující se skrz nebo podél stacionární fáze, která je umístěna vkoloně. Je použitelná na látky nebo jejich deriváty, které lze převést do plynné fáze za použitých teplot.

Plynová chromatografie je založena na mechanismu adsorpce, rozdělování nebo vylučování.

Přístroj

Přístroj se skládá z dávkovacího zařízení, chromatografické kolony umístěné v termostatu, detektoru a systému na zpracování dat (nebo integrátoru, popřípadě zapisovače). Nosný plyn protéká kolonou kontrolovanou rychlostí nebo při kontrolovaném tlaku do detektoru.

Stanovení se provádí bud' při konstantní teplotě, nebo podle daného teplotního programu.

Dávkovací zařízení

Přímé nástřiky roztoků jsou obvyklým způsobem dávkování, pokud není v článku uvedeno jinak. Nástřik může být prováděn bud' přímo na začátek kolony za použití stříkačky nebo dávkovací smyčky, nebo do vstřikovací komůrky, která může být opatřena děličem toku.
Nástřiky plynné fáze mohou být prováděny pomocí statických nebo dynamických head-space dávkovacích systémů.
Dynamické head-space dávkovací systémy pro adsorpci a desorpci obsahují probublávací zařízení, pomocí kterého jsou těkavé látky uvolňovány z roztoku a vyplavovány do adsorpční kolonky udržované na nízké teplotě. Zadržené látky jsou pak desorbovány do mobilní fáze rychlým ohřátím adsorpční kolonky.
Statické head-space dávkovací systémy obsahují termostatovanou komůrku, do které se vkládají uzavřené nádobky, obsahující pevné nebo kapalné vzorky na předem stanovenou dobu, potřebnou k ustavení rovnováhy těkavých složek vzorku mezi pevnou nebo kapalnou fází a plynnou fází. Po dosažení této rovnováhy je předem určené množství plynné fáze z lahvičky dávkováno do plynového chromatografu.

Stacionární fáze

Stacionární fáze jsou umístěny v kolonách, které mohou být:

Kapilární kolony mají vnitřní průměr 0,1 mm až 0,53 mm a délku 5 m Až 60 m. Kapalná stacionámí fáze, která může být chemicky vázaná na vnitřní povrch kolony tvoří film 0,1 μm až 5,0 μm silný.

Náplňové kolony vyrobené ze skla nebo z kovu jsou obvykle 1 m až 3 m dlouhé s vnitřním průměrem 2 mm až 4 mm. Stacionární fáze jsou nejčastěji porézní polymery nebo tuhé nosiče impregnované kapalnou fází.

Nosiče pro analýzu polárních látek v kolonách se stacionárními fázemi nízké polarity a s nízkým pokrytím musí být inertní, aby se předešlo chvostování píků. Reaktivita materiálů, z nichž je vyroben nosič, může být snížena silanizací, která předchází jejich pokrytí kapalnou fází. Často se používají kysele prané žárově kalcinované diatomitové křemeliny. Nosiče mají různou velikost částic. Nejběžněji používané jsou částice v rozmezí velikostí 150 μm až 180 μm a 125 μm až 150 μm.

Mobilní fáze

Retenční čas dané složky a účinnost kolony závisejí na průtokové rychlosti nosného plynu; retenční čas je přímo úměrný délce kolony a rozlišení je úměrné druhé odmocnině délky kolony. Pro náplňové kolony se obvykle průtoková rychlost nosného plynu vyjadřuje v mililitrech za minutu při atmosférickém tlaku a pokojové teplotě a měří se na výstupu z detektoru, bud' kalibrovaným mechanickým zařízením, nebo bublinkovým průtokoměrem, zatímco kolona je termostatována na pracovní teplotu. Lineární průtoková rychlost nosného plynu náplňovou kolonou je nepřímo úměrná druhé odmocnině z vnitřního průměru kolony při dané objemové průtokové rychlosti. Průtokové rychlosti 60 ml/min v koloně o vnitřním průměru 4 mm a 15 ml/min v koloně o vnitřním průměru 2 mm dávají stejné lineární rychlosti a tudíž podobné retenční časy.

Nejčastěji používanými nosnými plyny pro náplňové kolony jsou helium nebo dusík, zatímco pro kapilární kolony dusík, helium a vodík.

Detektory

Obvykle se používají plamenoionizační detektory, ale podle účelu analýzy mohou být použity i další detektory: elektronového záchytu, dusíko-fosforový, hmotnostní spektrometr, tepelně vodivostní, spektrofotometr v infračervené oblasti s Fourierovou transformací a jiné.

Pracovní postup

Kolona, dávkovací zařízení a detektor se stabilizují při teplotách a průtocích plynů předepsaných v lékopisných článcích, pokud není dosaženo stabilní nulové linie. Připraví se roztoky) zkoušené látky a porovnávací roztok(y), jak je předepsáno. Roztoky musí být prosty pevných částic.

Kritéria pro posouzení vhodnosti systému jsou popsána ve stati chromatografické separační metody (2.2.46). V této stati je rovněž uveden rozsah, v jakém mohou být nastaveny parametry chromatografického systému, aby byly splněny požadavky testu způsobilosti.

Statická head-space plynová chromatografie

Head-space plynová chromatografie je metoda zvláště vhodná pro dělení a stanovení těkavých látek přítomných v pevných nebo kapalných vzorcích. tato metoda je založena na analýze plynné fáze, která je v rovnováze s pevnou nebo kapalnou fází.

Přístroj

Přístroj se skládá z plynového chromatografu opatřeného zařízením pro zavádění zkoušeného vzorku, které může být připojeno k modulu, jenž automaticky ovládá tlak a teplotu. Je-li to nutné, může být připojeno zařízení pro eliminaci rozpouštědel.

Analyzovaný vzorek se vpraví do lahvičky opatřené vhodným uzávěrem a systémem ventilů umožr~ujícím průchod nosného plynu. Lahvička se umístí do termostatované nádobky vyhřívané na vhodnou teplotu podle povahy zkoušeného vzorku.

Vzorek se zahřívá na tuto teplotu dostatečně dlouho, aby se ustavila rovnováha mezi pevnou nebo kapalnou fází a plynnou fází.

Nosný plyn se zavádí do nádobky a po předepsaném čase se otevře vhodný ventil, takže plyn expanduje a unáší zplyněné látky do Chromatografické kolony.

Místo chromatografu speciálně vybaveného pro zavádění vzorků je též možné použít plynotěsnou stříkačku a běžný chromatograf. Ustavení rovnováhy pak probíhá v oddělené komůrce a plynná fáze se dávkuje do kolony při zajištění podmínek zaručujících, že nedojde k porušení rovnováhy.

Pracovní postup

Použitím porovnávacích vzorků se určí vhodné instrumentální podmínky k dosažení vhodné odezvy.

Přímá kalibrace

Do stejných lahviček se umístí odděleně zkoušený vzorek a všechny porovnávací vzorky, jak je předepsáno v lékopisném článku, přičemž se zabrání kontaktu mezi dávkovacím zařízením a vzorky.

Lahvičky se hermeticky uzavřou a vloží do termostatovaného prostoru udržovaného na teplotě a tlaku předepsaných v článku; po ustavení rovnováhy se provede chromatografická analýza za předepsaných podmínek.

Standardní přídavek

Do sady stejných vhodných lahviček se umístí stejné objemy zkoušeného vzorku. Do všech lahviček, kromě jedné, se přidají vhodná množství porovnávacích vzorků, které obsahují známé koncentrace stanovované látky, takže vznikne řada vzorků obsahujících postupně vzrůstající koncentrace stanovované látky.

Lahvičky se hermeticky uzavřou a vloží se do termostatovaného prostoru udržovaného na teplotě a tlaku předepsaných v lékopisném článku. Po ustavení rovnováhy se provede chromatografická analýza za předepsaných podmínek.

Metodou nejmenších čtverců se vypočítá lineární rovnice přímky a z ní se určí koncentrace stanovované látky ve zkoušeném vzorku.

Alternativně se vynesou do grafu střední hodnoty naměřených dat proti přidaným množstvím stanovované látky. Extrapoluje se přímka spojující body na grafu, až protne osu koncentrací. Vzdálenost mezi tímto bodem a průsečíkem os představuje koncentraci stanovované látky ve zkoušeném vzorku.

Postupný odběr (opakovaná bead-space extrakce)

V případě, že je požadována metoda postupného odběru, je podrobně popsána v lékopisném článku.